0 引言 Introduction

由创伤、骨关节炎和骨软骨病等引起的软骨损伤和退化，最终可导致膝关节疼痛、畸形、活动障碍等异常表现，严重时甚至致残[1-2]。由于关节软骨缺乏血管、淋巴和神经营养及氧气依赖性扩散特性，其自我修复能力很差，目前临床上常用微骨折术、骨软骨移植、自体/异体软骨细胞移植等技术和方法治疗关节软骨缺损[3-6]，取得了不同程度的疗效。但还有很多问题需要解决，如修复组织是纤维软骨、承重区修复效果不明显且易于复发等；同时供区有限，大块软骨缺损难以应用，易造成疾病传播和免疫排斥反应等一系列问题，制约传统治疗方法对骨软骨缺损修复的进展。因此，探究新型和有效促进软骨再生修复的方法具有重要的临床意义。

近年来，组织工程和再生医学技术逐渐成为研究热点，为软骨修复的质量提升带来新的希望。脂肪来源血管基质成分是脂肪组织中成熟脂肪细胞以外的混合细胞群，包括脂肪来源干细胞、脂肪前体细胞、巨噬细胞、内皮细胞和周细胞等[7-10]。脂肪来源血管基质成分含量丰富、获取简便，大量的动物和临床实验证实了脂肪来源血管基质成分局部移植均可促进关节软骨修复[11-12]。此外，前期研究已成功构建脱细胞真皮基质/生物矿化胶原骨软骨一体化支架，具有良好生物相容性特征[13]。

实验拟采用脂肪来源血管基质成分复合脱细胞真皮基质/生物矿化胶原骨软骨一体化支架，观察其生物相容性和体外成软骨的作用，为下一步脂肪来源血管基质成分复合骨软骨一体化支架修复骨软骨损伤动物实验提供相应的研究基础。

1 材料和方法 Materials and methods

1.1 设计 体外对比观察实验。

1.2 时间及地点 实验于2019 年7 至10 月在北京市创伤骨科研究所完成。

1.3 材料1.3.1 主要试剂与材料 Ⅰ型胶原酶、胰酶、Trizol 试剂、DMEM 高糖、低糖培养基和胎牛血清购自美国GIBCO 公司；10%的CaCl2溶液、阿利辛蓝染料购自北京索莱宝生物科技有限公司；地塞米松和ITS+购自Sigma 公司；cDNA Synthesis SuperMix 和UltraSYBR Mixture 购自日本Takara 公司；糖胺多糖定量检测试剂盒购自上海杰美基因医药科技有限公司；新鲜牛跟腱、新鲜牛皮来源市售；1%的胃蛋白酶、CCK8、氯化钠、磷酸三钙、无水乙酸、36.5%的甲醛和DAPI 染料购自美国Sigma 公司。

1.3.2 主要仪器 CO2细胞培养箱(SHELLAB 公司，美国)；SEM-6380LV 型扫描电镜购自日本电子；往复式真空泵(上海益化真空设备有限公司)；倒置相差显微镜(Olympus 公司，日本)；SHW200R 型匀浆机购自上海盛海威电气仪表有限公司；冷冻大容量离心机(湘仪，中国)；荧光显微镜(Leica，德国)；荧光定量PCR 仪(Bio-rad，美国)；Nanodrop ND-2000 分光光度计(Thermo Fisher 公司，美国)。

1.3.3 实验动物 12 月龄健康雌新西兰兔1 只，普通级，体质量2.5 kg，购自北京金牧阳实验动物养殖有限责任公司。

1.4 实验方法

1.4.1 骨软骨一体化支架的制备

生物矿化胶原悬液的制备：取牛跟腱5 g 剪碎，置于0.5 mol/L 乙酸溶液中，并加入2.5 g 胃蛋白酶，匀浆机匀浆；4 000 r/min 离心30 min，取上清，加入20%NaCl 体积500 mL；4 000 r/min 离 心15 min， 弃 上 清； 取 沉 淀 约100 mL，加入蒸馏水400 mL、0.5 mol/L 乙酸15 mL；置于透析袋中透析4 d，每日换水；透析结束后加入0.5 mol/L乙酸10 mL，4 ℃保存，制备胶原溶液。将胶原和β-磷酸三钙按质量比3 ∶7 通过匀浆机高速混匀，制备生物矿化胶原悬液。

脱细胞真皮基质的制备：①脱细胞处理：取新生小牛背部皮肤，脱毛、清洗，乙酸溶液浸泡溶胀2 h，使皮肤表皮、真皮和皮下组织各层有相对明显的界线，电动取皮刀切取厚度为1.0-2.0 mm 的真皮层；流水冲洗乙酸后，室温下用0.5%SDS 溶液水平振荡脱细胞2 h，更换新的SDS 溶液，再继续作用2 h；流水冲洗过夜；蒸馏水再次冲洗20 次后冷冻干燥机中冻干；②结构重塑：将脱细胞真皮基质置于0.5%胰蛋白酶溶液中，室温超声振荡2.5 h，冷冻干燥机中冻干；③交联：结构重塑后，用甲醛作为交联剂室温浸泡2 h；PBS 冲洗3 次，流水冲洗过夜，以去除残留的交联剂，再用蒸馏水清洗20 次后冻干，冷冻干燥，60Co 照射后备用。

骨软骨一体化支架的制备：将脱细胞真皮基质作为一体化支架上层。首先将冷冻干燥的脱细胞真皮基质放入聚丙烯圆筒形模具中(内径 5 mm、高 5 mm)，将制备的生物矿化胶原悬液经脱气后缓慢注入模具中。为使接触界面紧密，使悬液固化成型，即在-80 ℃冰箱内维持2 h，冷冻样品最终在冷冻干燥机内真空条件下冷冻干燥48 h，脱模后成功取出支架。另将制作好的支架用20 kGy60Co γ 射线辐照灭菌，4 ℃下密封保存备用。