0 引言 Introduction

随着医疗技术的进步，牙列缺损修复技术也随之不断改善，作为一门新兴学科，口腔种植学在近十年高速发展，其在美观和舒适度方面较传统义齿修复有很大的优势，因此越来越多的患者倾向于选择种植修复缺失牙，但在临床应用过程中也不乏局限性，比如口腔种植修复中骨结合状态会直接影响到种植修复的最终效果[1-2]，种植后的种植体周围炎也是影响其远期疗效的重要因素。糖尿病作为常见的系统性疾病之一，近年来发病率明显上升，而牙周病又被称为糖尿病的第六大并发症，所以糖尿病伴牙周病患者往往更易发生附着丧失，因而较正常人来说糖尿病患者的牙列缺损发病率明显增高，所以在种植手术的受众中糖尿病患者占很大的比例。但是有研究表明，糖尿病患者体内高糖环境会造成晚期糖基化终末产物的聚集，糖基化终末产物通过激活位于牙周组织的糖基化终末产物受体参与糖尿病患者牙周组织的愈合与改建，这些最终产物使牙龈和牙周成纤维细胞产生的基质蛋白减少，如胶原和骨钙蛋白等[3]。骨钙蛋白代表成骨细胞的活性，糖尿病患者体内的高糖环境通过抑制骨钙蛋白的表达对成骨细胞的增殖、分化产生影响，继而影响种植体植入后的骨结合[4-6]，所以一直以来糖尿病都被视为种植手术的相对禁忌证。糖尿病患者作为牙周病的高危人群，在种植修复方面有很大的需求。

作者所在团队前期通过实验发现，桂皮醛对高糖环境下的成骨细胞生物学性能具有促进作用[7-8]，且在质量浓度为20 mg/L 时作用最为明显[9]。电纺丝技术作为一种制备纳米级超精细纤维的新型加工方法[10-11]，由于其良好的性能现被广泛应用于各个领域。静电纺丝技术制备的电纺丝纤维膜具有良好的生物学性能， 在生物工程、药物载体、医学修复等方面有较好的应用前景[12-13]。通过静电纺丝技术制备的支架模型具有立体多孔的结构[14-16]，已被证实有利于细胞的增殖黏附[17]。因此，实验以静电纺丝支架为载体加载20 mg/L 的桂皮醛，观察两者是否具有协同促进成骨作用，为提高糖尿病患者种植后的骨结合率及远期疗效并应用于临床提供理论依据和数据支持。

1 材料和方法 Materials and methods

1.1 设计 细胞学体外实验。

1.2 时间及地点 实验于2018 年9 月至2019 年6 月在滨州医学院中心实验室完成。

1.3 材料 聚己内酯(sigma，美国)；MC3T3-E1 细胞、桂皮醛(四川大学赠送)；N，N-二甲基甲酰胺、三氯甲烷(国药集团试剂)；微量注射泵(康康医疗，安徽)；78-1 型磁力加热搅拌器(格莱莫，武汉)；酶标仪(SpectraMax M2，MolecuLar Devices，美国)；高压电源(东文高压电源，天津)；CO2细胞培养箱(Thermo Fisher Scientific，美国)；扫描电子显微镜(EVO LS15，Zeiss，德国)；激光扫描共聚焦显微镜(TCS SPE，Leica，德国)；紫外-可见光分光光度计(NanoDrop2000，Thermo Fisher Scientific，美国)；细胞计数试剂盒(cell counting kit-8，CCK-8，日本同仁)；荧光实时定量PCR 仪(Rotor-Gene 3000，Corbett，澳大利亚)；碱性磷酸酶检测试剂盒(碧云天)；α-MEM 培养液(Hyclone)。

1.4 实验方法

1.4.1 细胞培养 MC3T3-E1 细胞加入α-MEM 培养基(含体积分数10%的胎牛血清、100 mg/L 的链霉素、100 U/mL 的青霉素)，置于 37 ℃、体积分数5%CO2的培养箱中培养，经3次细胞传代后实验。

1.4.2 含桂皮醛培养液的配制 配制含桂皮醛20 mg/L 的高糖培养液，葡萄糖浓度为25 mmol/L[18]。

1.4.3 静电纺丝的制备 超泽(CZ)电子天平下称取2.4 g 聚己内酯置于玻璃瓶内，依次将7.5 mL 三氯甲烷及2.5 mL N，N-二甲基甲酰胺逐滴加入瓶内，78-1 型磁力加热搅拌器搅拌至聚己内酯完全溶解，搅拌过夜直至溶液稳定，获得电纺丝溶液。用10 mL 注射器吸取电纺丝溶液，然后将其固定于微量注射泵上，通过聚氯乙烯管与9 号针头(内径为0.6 mm)相连，将针头尖端接于直流高压电正极，平铺锡箔纸的接收板与高压电负极相连并将导线接地，设定参数：高压电压(25.) kV，流速3 mL/h，接收距离20 cm，在适宜湿度和室温条件下纺织静电纺丝。电纺完成后将锡箔纸置于真空干燥箱内干燥24 h，小心揭下即可获得静电纺丝薄膜。

1.4.4 细胞增殖实验 将处于对数生长期的MC3T3-E1 细胞以5×107L-1的细胞浓度接种于96 孔板，设空白对照组、聚己内酯组、药物组和联合组，每组5 个复孔，每孔接种100 μL；培养24 h 后，空白对照组更换为含25 mmol/L 葡萄糖的完全培养液；聚己内酯组更换为含25 mmol/L 葡萄糖的完全培养液，并加入聚己内酯薄膜；药物组加入含20 mg/L 桂皮醛与25 mmol/L 葡萄糖的完全培养液；联合组更换为含20 mg/L桂皮醛与25 mmol/L 葡萄糖的完全培养液，并加入聚己内酯薄膜。培养 1，4，7 d 时，每孔加入100 μL CCK-8 混合液孵育1 h，用酶标仪测定450 nm 波长下的吸光度值(A值)。