纯钛及钛合金由于其良好的生物相容性和卓越的机械性能而被广泛应用于牙种植体。但是，一般而言钛金属本质上是生物惰性的，很难直接与周围骨组织形成稳定牢固的骨结合。于是，学者们想出各种方法（如机械打磨、喷砂、酸蚀及热处理等）对种植体表面进行改性，以期获得良好的生物活性，促进成骨细胞的生长和种植体周围骨组织的形成[1-3]，但最近有研究表明热处理可能会改变种植体表面的结构和性能，从而产生有利或不利的影响[4-5]。本研究拟将成骨细胞接种到不同的钛片表面进行培养，观察成骨细胞早期黏附、增殖及分化的情况，以探讨热处理对该种植体表面活性的影响。现报道如下。

1 资料与方法

1.1 材料及试剂 商业纯钛片，直径为10 mm或30 mm，厚2 mm（宁波广慈医疗器械有限公司）；胎牛血清、-MEM培养基及胰酶（Gibco公司，美国）；曲拉通（TritonX-100，Sigma公司，美国）；多聚甲醛（Paraformaldehyde，ProSciTech公司，澳大利亚）；鬼笔环肽（Rhodamine phalloidin，Sigma公司，美国）；碘化丙啶（Propidiumiodide，Sigma公司，美国）；碱性磷酸酶活性测定试剂盒（Wako公司，日本）；骨钙素含量检测试剂盒（Biomedicaltechnology公司，美国）。荧光正置相差显微镜（ECLIPSE-80I，Nikon公司，日本）；多光谱酶标仪（产品型号：Spectra-Max Plus 384，厦门市宝能科技有限公司，中国）；图像处理软件（Image-proplus4，Media Cybernetics公司，美国）。

1.2 方法

1.2.1 钛片表面处理及分组 钛片表面先用320、500、800和1200目碳化硅水磨砂纸逐级打磨抛光，然后经大颗粒金刚砂喷砂处理，压力为4MPa；接着依次置于丙酮、75%乙醇、去离子水中各超声清洗15min，50℃干燥后备用。将喷砂清洗后的钛片用0.11mol/LHF和0.09mol/LHNO3混合液处理10 min，去离子水冲洗，50℃干燥；然后放于80℃的5.8 mol/L HC1和8.96 mol/L H2SO4混合液中浸泡30min，冲洗干燥；再接着用80℃的0.1 mol/L HCl和8.8 mol/L H2O2的混合液处理20min，冲洗干燥；最后，随机选取一半经过以上步骤处理的钛片设为对照组（9片），剩下的一半钛片经400℃高温处理1 h并自然冷却，设为实验组（9片）。所有的钛片均分别用丙酮、75%乙醇、去离子水各超声清洗15min，50℃干燥后即可进行表面表征，而用于细胞培养的钛片需在紫外线下正反面各照射1h。

1.2.2 细胞培养 将两组钛片分别放入24孔和6孔细胞培养板中，将传至第3代的小鼠颅骨来源的成骨前体细胞（MC3T3-E1）接种到材料表面；接种密度：直径为10mm的小钛片1×104个细胞/片，直径为30mm 的大钛片1×105个细胞/片。加入含10%胎牛血清的培养液1ml或3ml，在37℃、95%湿度、5%CO2的孵箱中密闭培养，每3天更换1次培养基。

1.2.2.1 细胞形态观察 将分别培养了1、3和24h的小钛片取出，先用37℃的PBS溶液轻轻漂洗，以去除未牢固粘附的细胞，接着用4%多聚甲醛溶液在4℃冰箱固定30min，继续用PBS冲洗3遍；0.1%曲拉通渗透3 min，PBS冲洗3遍，牛血清白蛋白非特异性封闭3min；接下去用结合有FITC的鬼笔环肽（5 g/ml）在37℃避光的条件下处理50 min，PBS冲洗3遍；最后用50g/ml的碘化丙啶同样在37℃避光的条件下5 min，PBS充分漂洗以去除残余的染料。

经过染色的钛片马上用荧光正置相差显微镜观察并摄片。每片钛片任选10个视野摄片，并随机选择30个细胞用于细胞形态因子分析[6]。所有图片用专用软件处理，其中细胞形态因子的计算公式为：=4 A/p2，A代表细胞伸展的面积，P表示细胞的直径。当形态因子为最大值1时代表一个完美的圆，而细线形状物体的形态因子为最小，趋向于0。

1.2.2.2 成骨细胞的早期黏附和增值能力检测 两组钛片分别于接种细胞后1h、3h、24 h、4 d和8 d取出，用PBS洗去未附着的细胞，同时将接种了细胞的钛片转移到新的细胞培养板中（减少附着在细胞培养板上而不是钛片上的成骨细胞的干扰影响），每孔加入1 ml柠檬酸缓冲溶液，置于－80℃低温冰箱中保存。等样品收集完毕，用反复冻融法将所有的样品连续冻融3次，收集细胞裂解液，离心，取上清液用于细胞DNA含量测定。本研究采用特定的试剂盒检测总的细胞DNA含量来推测细胞数。根据厂家提供的检测说明，20 l上清液置于96孔细胞培养板中，再用80 l TE工作液稀释，接着加入100 l picoGreen工作液，避光室温孵育2～5 min，多光谱酶标仪测量荧光强度（Ex485nm/Em510nm）。最后，根据标准曲线求出待测样品DNA的含量。

1.2.2.3 碱性磷酸酶（ALP）活性测定成骨前体细胞在钛片表面分别培养4、7和14 d，弃去细胞培养基，用PBS清洗3遍，加特定细胞裂解液4℃作用15 min，收集后12 000 r/min 4℃离心15 min，取上清液。所有样本用ALP检测试剂盒检测ALP活性。具体操作方法为：取20 l待测样品与100 l工作液混合，37℃避光孵育15min，最后加80 l NaOH溶液终止反应，405 nm读取吸光度值求得ALP活性。同时用同样的样本经稀释后与BCA蛋白检测工作液混合，37℃避光孵育30min，570 nm读取吸光度值求得细胞总蛋白浓度。细胞内 ALP活性值均用相应的细胞总蛋白浓度予以校准，以获得相对ALP活性值。